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如何對包涵體蛋白進行表達與復性

更新時間:2022-01-18點擊次數:1928

關于包涵體的復性一直是生物制藥的瓶頸,包涵體的處理一般包括這么幾步:菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復性以及純化。

一、包涵體蛋白的表達

在平板上挑取單菌落,接種于含有氨芐青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培養基中,37 ℃過夜培養,然后轉接到100 ml LB 培養基中,37 ℃培養至A600 為0.4~0.6時,加入IPTG 至終濃度為0.5mmol/L 誘導3.5 h。8000 r/min 離心5 min 收集菌體,加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl,冰浴下超聲波破碎后12000 r/min離心30 min收集沉淀。

二、包涵體的洗滌
在包涵體中加入包涵體洗滌液:50 mmol/L Tris—HCl,1 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl,w=0.5%TritonX-100,pH 8.0;37℃振蕩洗滌1~2 h,然后8 000 r/min 離心15 min,收集沉淀。

三、包涵體的溶解
洗滌后的包涵體加入適量的(包涵體溶解液):6 mol/L 尿素,50 mmol/L Tris—HCl,1 mmol/L  EDTA,50mmol/L NaCl,10 mmol/L β-ME,pH 8.0(注:β-ME用時現加),于磁力攪拌器上攪拌過夜,1000  r/min離心30 min,取上清即得包涵體溶解液。

四、包涵體的復性
包涵體的復性目前常用的主要有兩種方式:1,稀釋溶液,但是操作的液體量大,蛋白稀釋;2,透析,超濾或電滲透析去除變性劑。

1.包涵體的稀釋復性
設定不同的復性條件:蛋白質量濃度、尿素濃度、溫度、氧化還原條件、加入Ttiton X-100與環糊精的量、復性時間等,使變性溶解的包涵體稀釋復性,復性一定時間后取樣測酶活性。

2.包涵體的透析復性
包涵體蛋白的復性將8 mol/L 尿素溶解后的樣品裝入透析袋,密封置于復性液I(0.2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L NaCl;5%甘油;5 μmol/L EDTA;pH8.5),4 ℃ 透析12 h 后再轉入復性液II(0.2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L NaCl;)4 ℃ 透析12 h,12000 r/min 離心30 min,收集上清進行蛋白濃度及活性測定。


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