1949 年至 1960 年這一段時間可以稱為冷凍保存的“甘油時期"，這一時期對生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護劑。Lovelock（1959）等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學保護劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜（DMSO）。而且，用于冷凍保存的儀器也有明顯的發(fā)展。目前，無論是冷凍保存理論、各種保護劑、冷凍用品和設(shè)備以及各種生物材料的保存與復(fù)蘇技術(shù)都已十分成熟和完備。

冷凍與復(fù)蘇原理

在低于-700C 的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低， 細胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。

這種因細胞內(nèi)部結(jié)冰而導致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。

如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時，大量水分會因此進入細胞內(nèi)，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。

當溫度進一步下降，細胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。

在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2 分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。

冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。

冷凍速率

冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化:當細胞被冷至-50C時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰;當被冷至-5~-150C之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學能。其結(jié)果是，細胞內(nèi)水分子為了和細胞外水分子保持化學能的平衡，會向細胞外流動。

冷凍保存溫度

冷凍保存溫度是指能長期保存細胞的超低溫度，在此溫度下，細胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過長期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同。但從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度(-1960C)是目前最佳的冷凍保存溫度。在-1960C時，細胞的生命活動幾乎*停止，但復(fù)蘇后細胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應(yīng)用-700C~-800C保存細胞，短期內(nèi)對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。在冰

點到-400C范圍內(nèi)保存細胞的效果不佳。

復(fù)蘇速率

冷凍保護體外培養(yǎng)物，除了必須有最佳的冷凍速率、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時也必須有最佳的復(fù)溫速率，這樣才能保證最后獲得最佳冷凍保存效果。復(fù)溫速率是指在細胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當也會降低凍存細胞存活率。一般來說，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在370C水浴中，于1-2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細胞損傷。復(fù)溫時造成的細胞損傷非常快，往往在極短的時間內(nèi)發(fā)生。

冷凍保存方法

按照冷凍保護液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍.存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-700C~-800C，然后直接投入液氮進行保存;或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護液保護懸浮細胞，直接投入液氮進行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細胞凍存zui常用的仍是前一種方法。

非玻璃化凍存方法

下面以腫瘤細胞和雜交瘤細胞為例:在使用DMSO前，不要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時最好帶手套。在將細胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧、以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。應(yīng)注意控制凍存細胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細胞才具有凍存價值。另外，在每批細胞凍存一段時間后，要復(fù)蘇1~2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污

染。凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復(fù)蘇時，需要從-1960C的液氮中取出凍存管，立即投入37^ 400C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險。

玻璃化凍存方法

以下以人單核細胞為例:玻璃化凍存法對細胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的

凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。因為玻璃化冷凍保護液中的冷凍保護劑的濃度較高，室溫下對細胞具有毒性(但在40C時 毒性大為減弱)。所以，冷凍保護液的滴加全過程必須在40C冰浴中進行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過快，則在細胞外產(chǎn)生很高的滲透壓，造成細胞膜的損傷，導致細胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護劑有足夠的時間緩慢滲透到細胞內(nèi)，達到細胞內(nèi)外的平衡。

凍存細胞的復(fù)蘇方法及注意事項

非玻璃化凍存復(fù)蘇方法

主要材料:

(1)儀器設(shè)備:恒溫水浴箱、高速離心機。

(2)培養(yǎng)用液:*培養(yǎng)液。

復(fù)蘇過程:

(1)調(diào)配370C~ 400C的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至370C~ 400C。

(2)從液氮中取出凍存管，立即投入370C~400C溫水中迅速晃動，直至凍存液完

全溶解。

(3)將細胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻。

(4)將細胞懸液經(jīng)800~1000r/min離心5min，棄上清夜。

(5)向細胞沉淀內(nèi)加入*培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶

內(nèi)，補足培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

結(jié)果:

復(fù)蘇后的細胞應(yīng)該保持其凍存時的活力，活細胞數(shù)達90%以上。

注意事項:

細胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護液，防止冷凍保護劑對細胞產(chǎn)生毒性。實驗人員在復(fù)蘇細胞過程中，同樣應(yīng)具有自我保護意識，避免被液氮凍傷。

玻璃化凍存復(fù)蘇方法

主要材料:

(1)設(shè)備:高速離心機。

(2)培養(yǎng)用液:添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液、培養(yǎng)液。

操作過程:

(1)將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。復(fù)溫速率約5600C/min。

一次可以進行多個凍存管的復(fù)蘇。

(2)將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中。

(3)沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶

液。qian10min以0.2m1/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接

著的15min以0.75m1/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全過

程約為65min，都在冰浴中進行。

(4)將稀釋后的細胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。向細胞沉淀中加入

培養(yǎng)液重新懸浮細胞，用于培養(yǎng)。

結(jié)果:

復(fù)蘇后的細胞應(yīng)該保存其凍存時的活力，活細胞數(shù)達90%以上。

注意事項:

復(fù)蘇時，冷凍保護液的稀釋及去除過程與凍存前冷凍保護液的滴加過程一樣，不能在室溫下而必須在40C冰浴中進行，避免在室溫下冷凍保護劑對細胞產(chǎn)生毒性。稀釋過程也要緩慢進行，保證有足夠的時間讓冷凍保護劑從細胞內(nèi)滲出，以達到細胞內(nèi)外的平衡，避免高滲透壓的損傷。

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