精品黑人一区二区三区久久丨久久欧美国产伦子伦精品丨久久国产精品人妻一区二区丨99久久精品免费看国产一区二区三区丨亚洲综合在线一区二区三区

010-56256916

技術(shù)文章

TECHNICAL ARTICLES

當前位置:首頁技術(shù)文章蛋白異源表達純化那些事兒

蛋白異源表達純化那些事兒

更新時間:2020-05-07點擊次數(shù):1624

研究蛋白質(zhì)功能、生產(chǎn)功能型蛋白質(zhì)基本都離不開蛋白質(zhì)的異源表達及純化,今天小編將從以下幾個方面與大家聊一聊蛋白質(zhì)表達、純化的那些事。

1、 標簽選擇

目前常見的表達標簽有His-tag(組氨酸標簽)、GST-tag(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標簽)、MBP-tag(麥芽糖結(jié)合蛋白標簽)、CBD-tag(幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)標簽)等。每種標簽都具有*的性質(zhì),比如標簽的分子量、對蛋白可溶性的調(diào)節(jié)能力、對蛋白折疊的影響、是否需切除等。根據(jù)自己要純化的蛋白的特性,選擇合適的標簽。標簽選的好,后續(xù)的實驗事半功倍。

2、 載體構(gòu)建

選好要用的標簽后,就要準備構(gòu)建表達載體了。目前已有很多商品化的載體可供選擇,例如帶His-tag的pET28系列,帶MBP-tag的pMAL系列等。絕大多數(shù)的載體系列,都包含了標簽插入N端或C端的形式,可以根據(jù)自己的蛋白的特質(zhì)進行靈活選擇。插入蛋白的編碼基因時需要注意,不要出現(xiàn)移碼。如果想要自己從頭構(gòu)建載體,別忘了插入合適的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。啟動子序列一般使用誘導(dǎo)型啟動子,組成型啟動子會導(dǎo)致外源蛋白過早表達積累,不利于宿主增殖。

3、 宿主選擇

常見的宿主有大腸桿菌、哺乳動物細胞、酵母以及昆蟲。以大腸桿菌來說,適合做異源表達的菌株為BL21及其衍生菌株,但仍需要根據(jù)載體中選擇的轉(zhuǎn)錄、翻譯元件來挑選。BL21中內(nèi)源性的蛋白酶基因缺失,因此是一種適合于外源蛋白表達的菌株,但是它沒有T7 RNA聚合酶,所以不能用于含T7啟動子蛋白表達;BL21(DE3),在BL21的基礎(chǔ)上整合了T7噬菌體基因組,適合T7表達系統(tǒng),如pET系列;BL21(DE3)PLySs,在BL21(DE3)基礎(chǔ),附帶了T7溶菌酶基因,可以更為嚴謹控制T7聚合酶的表達。需要注意的是,由于核酸內(nèi)切酶(endA1)重組酶(recA1)等基因的存在,質(zhì)粒在BL21系列菌株中不那么穩(wěn)定,可能出現(xiàn)整合至基因組、丟失、突變等現(xiàn)象,所以構(gòu)建好的載體仍需保存在DH5α之類的菌株中。

4、 培養(yǎng)條件優(yōu)化

以大腸桿菌表達系統(tǒng)為例,菌種復(fù)蘇和種子培養(yǎng)時都可以使用LB培養(yǎng)基,在發(fā)酵階段使用氨基酸含量更高但糖源更低的培養(yǎng)基則更好,如TB培養(yǎng)基,以促進蛋白質(zhì)的合成和積累。如果使用的是誘導(dǎo)型的啟動子,則應(yīng)在菌體生長至對數(shù)生長期后期時加入IPTG之類的誘導(dǎo)劑。加入誘導(dǎo)劑后,培養(yǎng)溫度需要調(diào)低至16-30℃。培養(yǎng)溫度越低,蛋白質(zhì)累積的越慢,越不容易產(chǎn)生包涵體。

5、 純化柱料選擇

每一種標簽都有對應(yīng)的純化柱料。GST-tag使用谷胱甘肽凝膠,MBP-tag使用多糖樹脂,CBD-tag使用幾丁質(zhì)樹脂,His-tag則使用偶聯(lián)了二價金屬離子的填料,其中常見的是偶聯(lián)鎳離子的,俗稱鎳柱。

NEBExpress鎳柱填料(S1428S)于2019年11月全新上市,另有預(yù)裝離心柱形式(S1427S/L),更適合做篩選階段的小量蛋白純化,純化1mg His標記的蛋白質(zhì),只要15分鐘。

每 1 ml 鎳柱填料可純化≥10 mg 組氨酸標簽蛋白;

高特異性結(jié)合帶有His-tag的蛋白質(zhì),分離和純化后純度>95%;

牢固的鎳離子結(jié)合使其對 EDTA 和還原劑有*的耐受性,與常見的基于去污劑的細胞裂解試劑兼容。

熱線電話:010-56256916

關(guān)注公眾號

Copyright © 2025 安諾倫(北京)生物科技有限公司 版權(quán)所有    備案號:京ICP備16059737號-3

技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)    管理登錄    sitemap.xml

主站蜘蛛池模板: 欧美亚洲色欲色一欲www| av片在线观看免费| 99国产精品无码| 精品少妇人妻av一区二区三区| 丁香五月缴情在线| 久久不见久久见免费影院国语| 天天爽天天爽天天爽| 欧洲熟妇色xxxx欧美老妇多毛网站 | 熟妇丰满大屁股在线播放| 亚洲一区av无码少妇电影| 国产偷国产偷亚洲清高| 日本熟妇人妻xxxxx人hd| 国产va免费精品高清在线 | 亚洲中文字幕a∨在线| 国产成人毛片在线视频软件| 久久久久人妻一区精品下载| 成人免费观看做爰视频ⅹxx| 亚洲成色在线综合网站| 亚洲欧美日韩成人一区二区三区| 国内精品久久久久久影院8f| 日本三级带日本三级带黄| 国产女人喷潮视频免费| 国产女主播喷水视频在线观看| 无码av中文一二三区| 精品欧美h无遮挡在线看中文| 亚洲中文日产2021| 丰满少妇人妻无码| 久久青青草原国产免费| 久久久水蜜桃国产成人网站| 被拉到野外强要好爽黑人| 国模精品一区二区三区| 精品欧美一区二区三区久久久| 亚洲人成在线观看| 少妇高潮太爽了在线视| 成人精品动漫一区二区| 欧美日韩色另类综合| 欧美专区日韩视频人妻| 国产精品高潮呻吟av久久软件| 成人精品天堂一区二区三区| 国产美女精品自在线拍| 特黄大片aaaaa毛片|